致敏反应试验之封闭贴敷试验
试验原理
封闭贴敷试验（Buehler 试验）是采用封闭式斑贴诱导、激发方式将材料或其浸提液作用于豚鼠，在规定时间内观察豚鼠激发部位皮肤反应，以评价试验样品在试验条件下使豚鼠产生皮肤致敏反应的潜能。本试验是按照国家标准GB/T16886.10-2017《医疗器械生物学评价 第10 部分：刺激与皮肤致敏试验》的规定进行的。
仪器设备试剂
仪器设备 超净工作台、恒温水浴箱、压力蒸汽灭菌器等。
试剂 符合药典要求的极性和非极性浸提介质等。
试验前准备
样品制备
试验样品信息 委托单位应按要求提交试验样品的详细资料。
试验样品制备 根据GB/T 16886.12-2017《医疗器械生物学评价 第12 部分：样品制备与参照材料》中规定的原则制备试验样品。如试验样品的形状和尺寸适宜，则应不加改变直接用于试验，或剪为约25mm×25mm 大小用于试验；否则，可制备浸提液用于试验。
阴性对照制备 约25mm×25mm 大小的纱布块或浸提介质（不含有试验样品）以相同方式制备作为阴性对照，阴性对照需同时进行。
试验动物
GB/T 16886.10-2017《医疗器械生物学评价 第10 部分：刺激与皮肤致敏试验》指定白化豚鼠作为皮肤致敏试验动物。Hartley 白化豚鼠作为皮肤致敏试验动物历史已久，有丰富的试验资料积累。所以，选用Hartley 白化豚鼠作为皮肤致敏试验动物是合理的。
试验材料如为粉剂或液体，应至少使用10 只动物接触试验样品，至少使用5 只动物作为对照组。如需进行预试验，应另取动物。
对于浸提液试验，每一浸提液应至少使用10 只动物接触，至少使用5 只动物作为每一溶剂对照组。如需进行预试验，应另取动物。
如果10 只试验动物和5 只对照动物全部呈阴性反应，即使再进行10 只试验动物加5 只对照动物试验，也未必会出现阳性结果。但是，如出现任何疑似反应，则应进行再激发（见本试验的“分析判定”部分所述），如仍有疑似反应，则要重新进行试验，最少采用20 只试验动物和10 只对照动物。
试验过程
预试验
其目的在于确定主试验中所用试验样品的浓度。在主试验的局部诱导阶段，宜选择仅出现轻微红斑，但不对动物产生其他不良作用的最高浓度作为试验样品浓度；在主试验的激发阶段，宜选择不出现红斑的最高浓度作为试验样品浓度。预期局部使用的医疗器械，和采用通用溶剂制备、未经稀释的浸提液不需要进行预试验。
每种试验样品局部贴敷采用4 种浓度，使用合适的敷贴片贴敷于至少3 只动物的两腹侧部。（6±0.5）小时后除去包扎带和敷贴片。除去敷贴片后（24±2）小时和（48±2）小时，按Magnusson 和Kligman 分级标准评定试验部位皮肤红斑和水肿反应程度（见表）。
主试验
在试验开始前，对每只动物称重并编号后，用电剃刀剃去豚鼠全部试验部位（常为背部）的毛发，并观察每只动物的总体健康状况。
诱导阶段 将试验样品或浸透试验样品（预试验选定的试验样品浓度）的面积约8cm2 的敷贴片，局部贴敷于每只动物的左上背部位，（6±0.5）小时后除去包扎带和敷贴片。1 周中连续3 天重复该步骤，同法操作3 周。对照动物仅使用阴性对照同法操作。
激发阶段 最后一次诱导贴敷后（14±1）天，用试验样品对全部试验动物和对照动物进行激发。将试验样品或浸透试验样品（预试验选定的试验样品浓度）的面积约8cm2 的敷贴片，单独局部贴敷于每只动物去毛的未试部位，（6±0.5）小时后除去包扎带和敷贴片。
分析判定
结果观察
首次激发后或再次激发接触后（24±2）小时，除去激发部位及其周围部位的动物被毛，用温水彻底清洗脱毛区，并用毛巾擦干动物后放回笼中。脱毛后至少2 小时，按表中给出的分级标准对试验部位评分，并在除去激发敷贴片后（48±2）小时再进行评分。记录试验方法、动物体重、试验过程中所观察到的任何现象及结果。
结果评价
按Magnusson 和Kligman 分级标准，对照组动物分级小于1，而试验组中分级大于或等于1 时一般提示致敏。如对照组动物分级大于或等于1 时，试验动物反应超过对照动物中最严重的反应则认为致敏。如为疑似反应，推荐进行再激发以确认首次激发结果。试验结果显示为试验动物和对照动物中的阳性激发结果的发生率。偶尔，试验组出现反应的动物数量多于对照组，但反应强度并不超过对照组，在此情况下，可能需要在首次激发后1~2 周进行再次激发，以明确反应。所用方法与首次激发相同，只是采用动物腹侧未试验的部位。
注意事项
1. 该试验适用于预测中度至重度致敏物，不能采用GPMT 法试验的产品或接触表皮的产品可用该试验进行评价。
2. 用封闭式包扎带固定动物时，宜注意使动物能正常呼吸。首选弹性包扎带，宜由经过培训的专业人员进行操作。
3. 在结果观察阶段，为将结果评价偏差降至最低，特别推荐在不知试验处置信息的情况下进行读数。
4. 对于豚鼠致敏试验，为确保试验的再现性和敏感性，一般每6 个月要采用10 只动物用于阳性对照。在以比每6 个月更频繁的频率进行阳性对照物质试验时，可采用较少的豚鼠，宜至少采用5 只试验动物用于阳性物质，及5 只对照动物。
来源：《医疗器械安全通用要求检验操作规范》中国医药科技出版社
整理：奥咨达
【本文内容为转载，我公司不对本文所包含内容的准确性、可靠性或者完整性提供任何明示或暗示的保证，不对本文观点负责。如转载内容涉及版权等问题，请立即与我们联系，我们将迅速采取适当措施，以保障双方权益，谢谢。】