2项IVD注册技术审查指导原则发布
国家药监局关于发布肿瘤相关突变基因检测试剂和CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂2项注册技术审查指导原则的通告
(2019年第83号)
2019年12月5日 发布
为加强医疗器械产品注册工作的监督和指导，进一步提高注册审查质量，国家药品监督管理局组织制定了《肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用注册技术审查指导原则》和《CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂注册技术审查指导原则》，现予发布。
特此通告。
附件：1.肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用注册技术审查指导原则
2.CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂注册技术审查指导原则
国家药监局
2019年11月12日
附件1
肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用注册技术审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、 适用范围
本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测序（next
generation sequencing，NGS），又称为大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS），体外检测人体组织肿瘤细胞中的肿瘤相关基因变异。用于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的基因变异。肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。
基于NGS测序原理的体外诊断（In Vitro Diagnosis，IVD）检测可能包括以下步骤：样本收集、处理和保存、核酸提取及处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。同时，某些产品还可能会包括软件部分，但上述相关步骤并不一定被全部包括，应根据产品的具体设计流程来进行判断。对于每个检测步骤，申请人需要结合产品设计和临床意义来建立特定的可接受的质量评价指标和合格判断标准。此外，为满足产品特定预期用途，申请人需通过科学和适当的检测性能研究来确定适用的试剂、消耗品、仪器和软件。基于上述考虑因素，NGS检测产品的设计和工作流程中的任何差异均可能导致结果的不同，因此申请人需要清楚地描述相关检测性能指标。
分析性能评价的初衷在于提出产品性能有效性、安全性相关问题的假设，然后通过研究进行确认。NGS在测序通量及发现未知基因变异方面具有优势，但是在NGS技术应用需求及使用中存在包括相关临床样本收集处理、NGS检测内容、测序流程、数据分析、结果报告等各方面的挑战。本指导原则将重点关注实体瘤中检测具有临床意义的体细胞变异和确保高质量的检测结果。申请人应以患者的利益为中心，充分整合临床肿瘤学家对于精准诊治的观点，并充分考虑在我国推广应用的可操作性。申请人可采用多样化的靶向基因组合检测。由靶向基因产生的信息可能会被用于诊断分类，指导治疗决策，和/或为特定肿瘤提供预后评价，不同产品包含的基因数量可能存在较大差异。
本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
本指导原则不适用于全外显子检测、肿瘤全基因组测序、从头测序、游离DNA检测、RNA直接测序、病原体微生物及宏基因组学测序、胚胎植入前检测、疾病风险（含遗传风险）评估与预测、直接面向消费者测序及健康人群筛查。
二、NGS性能评价
（一）综述资料综述资料
主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容。
申请人在计划开发一个有针对性的基因检测试剂时，需确定其预期用途、待测基因数量、检测突变位点或者突变类型，包括将要检测的样本类型、适用人群以及哪些类型的检测信息将被评估和报告。还应考虑影响检测的设计、验证和质量控制的其他因素，并在试剂组成说明书中详细说明该产品包含的试剂组分及需要但未提供的试剂、设备及耗材。
作为IVD检测一般原则，申请人应首先定义申报产品的预期用途和检测性能，产品的预期用途将直接影响检测设计和检测性能以及测序和/或报告的基因类型。申请人需要前瞻性地确定应进行的研究指标（例如准确性）以及每种研究指标应该满足的标准。在设计和开发完成之后，验证研究其是否满足预定义的性能。如果检测不符合任何预定义的性能标准，则应分析原因、重新验证或修改预定义的性能指标。通过反复的设计、开发和验证，直到检测满足设定需求。在整个过程中申请人需要记录所有研究方案、研究过程和结果以及每项研究设计的理由。建议申请人列出样本处理、文库制备、测序、生信分析等环节主要质量控制参数。如文库浓度及片段长度、碱基识别质量值（Base Call Quality scores）、过滤后有效Reads数、有效测序深度（如经过去重处理等）、符合最低测序深度和平均测序深度要求的区域（%）等。
申请人应提供整个检测流程的标准操作程序文件（Standard Operating Procedure，SOP），对NGS技术检测全过程包括的样本收集处理、文库制备、测序、数据分析、结果报告等过程进行描述。生物信息学分析方面描述和记录数据处理和分析，包括变异识别、过滤和注释的所有过程。明确所有要使用的软件，包括来源（例如：内部开发以及第三方）以及主要修改。建议以列表形式描述所有需要的软件和/或数据库名称、版本及其功能。
（二）主要原材料的研究资料NGS检测过程主要包括样本收集处理、文库制备、测序、数据分析、结果报告等。
1.样本收集处理（如适用）
样本收集处理过程是保证样本具有能如实反映患者体征的关键环节。申请人需提交涉及样本收集及处理相关试剂主要原材料信息，如样本前处理试剂、样本运输保存试剂、核酸提取试剂的主要组成成分等。
2.文库制备及测序
测序文库构建及测序过程中所需试剂主要包含脱氧核糖核苷三磷酸、连接酶、聚合酶、逆转录酶、限制性内切酶、引物、探针、接头等；如为申请人自行研究的主要原材料，申请人应对测序文库构建的实验过程予以详述；并提供对各主要原材料的功能性研究。并对制备完成的原料成品进行质量检验以确认其符合标准要求，且整个生产工艺应稳定可控。如为申请人外购的主要原材料，应详述每一种原材料外购方来源，提交外购方出具的每种原材料性能指标及质量控制资料，并详述申请人对外购主要原材料的各指标质量要求以及确定该原材料作为本产品主要原材料的详细依据。核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease,DNase）和核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）污染。
3.生物信息分析及数据库要求
NGS的数据分析流程或生物信息学流程一般可以分为碱基识别、序列比对、变异识别和变异注释等。明确参考序列类型，不同突变类型可能需要开发不同的变异/突变检测算法。其次，应根据产品设计类型提供软件工具的范围和所需的验证类型。如涉及数据库使用，建议申请人提交数据库的溯源信息、数据库类型、完整性、实时性、维护以及分析软件的版本、性能验证等资料。
4.参考品要求
内部参考品是保证产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之一。参考品研究应包括原料选择、制备过程、定值研究及评价指标等。申请人应对内部阳性/阴性参考品的来源、基因序列设置等信息进行验证，并提供参考品溯源过程的测量程序或参考方法的相关信息及详细的验证资料。
具体要求如下：
4.1阳性参考品及阳性质控品：
4.1.1阳性参考品
理想状态下，阳性参考品应当包括对所申报产品每个基因型的质控样本。但考虑到基于NGS技术的可检测基因数量较多，申请人应结合产品预期用途、临床意义及基因类型等因素进行针对性和代表性的设计。
对于有明确肿瘤伴随诊断相关的基因，应考虑该类基因参考品设置的合理性和完整性，需包括伴随诊断相关的全部热点基因，建议采用临床样本或细胞系提取的核酸储备液作为原料。
对于具有显著临床意义或潜在临床意义的基因，应考虑代表性问题，明确具有临床诊断意义的基因类型及基因型中不同的变异类型。突变频率、变异类型的选取应具有代表性，包括不同外显子，不同基因变异突变等。如检测编码区较大且存在非热点区域设计（如大于1M），建议在阳性参考品中考虑对检测整体区域的灵敏度验证（主要关注SNV等），如混合的永生化正常人白细胞DNA储存液等。不同突变/变异的变异丰度及突变频率，浓度范围设置应具有代表性并提供这样设定的依据。阳性参考品的突变形式及拷贝数需采用有效方法进行确认，并明确接受标准。申请人在设计阳性参考品时可一并考虑检测限参考品的设置及确认方式，并提供相关的依据。
4.1.2阳性质控品
模拟病人样本的目标核酸序列，并用于质控整个检测过程，包括核酸提取（如适用）、文库构建、测序和数据分析。目前阳性质控检测和分析过程应与临床样本方式一致。
4.2阴性参考品及阴性质控品
阴性参考品及阴性质控品建议为正常临床样本的混合物或细胞系，应明确不含有目标区域肿瘤突变基因。
4.3精密度参考品
精密度参考品设置要求可参考阳性/阴性参考品。
4.4 PCR
试剂无模板质控品（No
Template Control，NTC）（如适用）
申请人应根据申报产品特点设置NTC质控品及检测接受标准，监测检测过程中是否存在污染。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料
NGS检测是一个复杂的工作流程，它由很多独立步骤组合而成。一般而言，对于每个检测组成部分，申请人应建立其特定检测的指标和验收标准。必须对NGS每个操作流程的性能表现进行一个内部的验证。每步流程都需要分别优化到一个最佳经验值，以此来综合决定最佳的实验操作条件及各参数的设置。
1.应能对反应体系涉及到的基本内容，如临床样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设置等，提供确切的依据，配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求。
2.主要生产工艺、反应原理介绍。逆转录过程（如涉及）及最佳反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotidetriphosphate，dNTP）浓度、阳离子浓度等。
3.申报产品如包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。如包括但不限于核酸体积、质量、浓度、纯度及完整性等。核酸浓度、纯度检测方法包括但不限于荧光法等；核酸完整性检测方法包括但不限于琼脂糖凝胶法等。
（四）分析性能评估资料
分析性能评估是反映产品主要原材料选择，生产工艺及反应体系等多方面因素设置是否合理的客观评价指标。检测试剂性能的研究方案应结合产品的反应原理，临床预期用途，使用条件等综合因素进行设计。性能研究应涵盖产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。
本部分内容将从NGS检验流程中的质量控制要求和主要性能指标两部分进行阐述：
1. NGS检验流程
检测方法中，应明确所有检测要素（如仪器、软件、消耗品、试剂）。确定设计方案和标准并详细记录设计研究过程。对于基于NGS的检测的每个组成，应该确定规范并记录。记录每个检测组成对于关键因素（如覆盖率、碱基质量等）的局限性。确定并记录基因组的检测区域，包括基因和变异类型，如果关键的测序区域不符合最低性能要求（如最小覆盖标准等），则应修改检测并重新验证以达到最低性能要求。同时，应在产品说明书和/或标签中明确可能影响或限制产品检测性能情形。
1.1样本制备
申请人需考虑可接受检测的样本类型对检测结果的影响，应明确组织样本采集标准依据。用于肿瘤组织突变基因检测的标本，在进行检测前，须对肿瘤细胞进行评估。肿瘤细胞所占比例需达到后续检测方法的要求。
在NGS检测试剂的设计开发过程中，申请人应对配套使用的核酸提取、分离、纯化及富集试剂进行验证并提供验证方案的依据，应明确样品质量（包括但不限于核酸浓度、纯度及完整性）的最低要求并进行质量控制。如分离/纯化后的核酸储备液质量（如浓度范围）不符合要求，应重新取材或扩大样本量再进行核酸分离/纯化。
1.2测序文库制备
文库制备是产生特定大小范围的DNA或cDNA片段的过程。文库质量非常重要，申请人应建立文库构建浓度、文库片段大小要求，文库浓度检测方法包括但不限于实时荧光定量PCR法；文库片段大小检测方法包括但不限于毛细管电泳法等。申请人应关注不同测序平台的性能特点，确保片段长度分布符合后续测序要求。如需要进行片段化处理。申请人应制定核酸序列片段化操作流程及质量控制方案。对经过片段化的核酸短序列的浓度及片段分布等参数进行验证。文库制备的关键步骤是在DNA片段的两端连接测序接头，接头序列是一段人为设计的序列，包含用于测序过程的多个目的的多个序列组分。如启动测序反应的通用测序引物序列，用于PCR扩增引物序列、锚定序列、索引（条形码）序列等。如申请人采用自定义序列，应提供设计依据及研究资料。加接头可以是独立的步骤，也可以在靶向序列富集过程中添加。申请人使用条码或标签时，需充分验证并满足测序的质量要求，如测序深度、覆盖度等条件。申请人应报告有效的条码或标签数量，并对每个条码或标签的序列及其位置有详细、清晰的记录。
1.3测序及碱基读取
目前可用的测序平台具有不同的测序方法，包括联合探针锚定聚合测序法、边合成边测序和离子半导体测序，以及不同的检测方法。尽管技术性能相似，但平台之间存在差异，特别是不同的DNA输入量要求、不同的测序通量、运行时间、测序读长和不同的碱基识别技术。这些差异会影响仪器处理低质量样本的能力、检测插入/缺失/融合等变异类型的能力以及样本通量。
申请人应根据所选用的测序平台，选择合适的参数指标对测序质量进行监控，制定相应的管理制度及质量标准，并明确失控情况下的纠正措施。
申请人应根据具体应用情况，如测序区域的大小及序列特征等因素确定测序所需要的覆盖度及深度。在测序过程中，申请人应建立标准操作流程及质量控制方案监控整个测序过程中的测序质量。申请人应描述清晰，如在确立测序深度时需要明确指出是平均测序深度还是最低测序深度；还需要说明测序数据类型，如原始测序数据（原始reads数）、过滤之后的高质量测序数据或去除重复之后的测序深度。
碱基识别是指识别一段基因序列片段每一个位点的核苷酸的过程。不同测序平台具有不同的测序偏好性，可影响碱基读取过程中的错误类型与比率。碱基读取后，申请人应对每个碱基读取的质量进行评估。
1.4生物信息学分析
申请人应对生物信息学分析流程有完整的记录，建立完善的生物信息学分析软件的版本控制方案。申请人应建立生物信息学分析标准操作流程及质量控制方案，保证测序数据的分析、解读及报告的准确性与严谨性。生物信息学分析流程应描述清晰，包括每一步骤使用软件的名称、版本、参数设置要求，包括但不限以下指标：说明检查每个位点的碱基质量值和每个读段的平均质量值，碱基的频率分布，读长分布及是否存在重复序列和人工序列的评价方法，以保证按照该流程生物信息学分析结果可复现。
生物信息学分析应至少报告具有明确临床指导意义的结果。生物信息学分析一般包括但不限于数据预处理、数据比对及质控、变异识别和变异注释。根据测序类型和检测报告的变异类型选择生物信息流程，并考虑变异识别和评估流程过程中的限制因素以及第三方生物信息学工具对整个生物信息流程的影响。
1.4.1数据预处理：申请人应说明分析流程使用的软件类型及数据预处理步骤。数据文件（如FASTQ格式文件）应包含质控参数，如每个位点碱基质量值的控制参数、GC含量以及序列长度分布等。明确测序碱基质量值（Base CallQuality，如质量值Q值得分）的阈值。明确判定实验有效的符合碱基质量值的最低百分比。如采用其他方法，应提供研究资料及选择依据。
1.4.2数据比对及质控：申请人应提供BAM （Sequence Alignment/Map）文件生成过程软件类型，每个样本数据参数标准以及判定实验有效的最低接受标准。提供参考序列的选择依据，如为特殊序列，应提供采用该序列的依据。
1.4.3突变分析：根据申报产品可检测的基因类型，申请人应确认软件工具类型及选择依据。明确不同基因类型质控标准以及判定实验有效的最低接受标准。
1.4.4突变注释：申请人应提供每个突变预测的功能性作用以及临床解释注释的形成过程及数据来源依据。
1.5软件研究（如适用）
根据申报产品预期用途，可能存在一些软件产品不包含在申报产品组成成分中，但生物信息分析过程中需要用到该软件，则该软件被视为检测系统一部分，申请人应提供该部分软件相关适用性研究资料。
1.6 NGS数据的存储、传输与共享（如适用）
用于储存原始和经过分析后的检测结果。建议申请人提交数据存储中心的安全性、稳定性、维护与升级方案以及异常情况处置方案等资料。
1.7公共/内部数据库应用（如适用）如申报产品的测序结果需要借助公共/内部数据库进行结果注释或报告解读，申请人需提供所使用的公共/内部数据库在产品检测中起到的作用说明，公共/内部数据库类型、功能介绍、版本号、标准操作流程及质量控制方案等。
2.主要性能指标
分析性能验证包括通过一组预定义性能评价方式，以证明性能是否足以满足其预期用途并符合预定义的性能标准。通常涉及是否符合统计学评价要求，或检测是否存在与患者的疾病相关的变异等。
2.1分析性能用样本设置要求
申请人应提供用于评估各项性能研究的标本数量和类型设定的依据。根据产品预期用途，样本研究应包括代表性变异和变异类型。研究应考虑与检测适应症相关的临床意义区域，跨不同基因区域的变异、难以测序或难以比对的基因区域，人工混合嵌合体以及任何其他变异类型、检测区域。例如：如果检测旨在用于检测和报告插入、缺失位点等，应包括但不限于不同大小的基因片段、突变所在区域等。
应在研究中使用含有与检测适应症相关的临床样本，临床样本应具有适当的代表性，确保可覆盖申报产品声称的临床相关序列变异等。
2.2准确性
2.2.1总体要求
准确性包括对比检测值与被检测值之间一致性。对于基于NGS测序原理的检测，通过与适当的对比方法比较，如核酸测序或其他经过验证的方法，评估申报产品准确性能。根据检测的性能指标，准确性研究应包括代表性变异和变异类型验证（准确性研究样本要求详见2.1分析性能用样本设置要求）。
对于每种变异类型以及代表性临床相关变异，应考虑变异频率。对于变异类型，为了确定检测的变异类型以及检测它们的测序区域（不管变异是否具有致病性），可以使用具有代表性的参考物质或具有高置信度的样本进行研究。对于临床相关的变异，准确性计算包含使用基于临床样本的研究数据与临床样本相关的指标。
准确性研究中应含有代表性临床相关变异与检测适应症的临床样本，以确保临床相关序列变异被检测和报告。准确性评估如采用前瞻性临床样本时，收集和处理的方式应与产品预期用途一致。如果前瞻性的临床样本不可用，则可以使用临床相关区域中含有特定变异的冻存临床样本或人类细胞系样本替代或补充研究。
根据待评价方法和对比方法对所有变异的检测结果分别计算阳性符合率（Positive Percent Agreement，PPA）、阴性符合率（Negative Percent Agreement，NPA）、阳性预测值（Positive Predictive Value，PPV）。通过检测评估的每种类型的变异，如单核苷酸多态性（Single Nucleotide Variant，SNV）、插入、结构变异，和测序区域范围（如高度同源、高度多态或其他困难的区域），分别计算PPA、NPA等。
表1 准确性评估方法
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对比方法
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总数
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阳性
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阴性
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检测方法
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阳性
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A
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B
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A+B
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阴性
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C
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D
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C+D
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总数
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A+C
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B+D
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A+B+C+D
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表1注：PPA通过将A（真阳性结果数）除以（A+C）、NPA通过将D（真阴性结果数）除以（B+D）。这些计算不应包含任何无应答或无效应答，无应答或无效应答结果应被单独列出（见表2）。根据适用情况计算每种变体类型以及临床相关变异PPA、NPA等。
表2 准确性评估方法
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对比方法
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总数
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阳性
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阴性
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检测方法
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阳性
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A
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B
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A+B
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阴性
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C
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D
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C+D
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无应答或无效应答
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E
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F
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E+F
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总数
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A+C+E
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B+D+F
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N
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表2注：准确性研究中无应答或无效应答的百分比应该被估计为（E + F）/ N以及95％的双侧置信区间。此外，应评价阳性结果中的无应答或无效应答E /（A + C + E）和阴性结果中的无应答或无效应答F /（B + D + F）。申请人应设定无应答或无效应答的最小可接受标准并提供依据。样本总数（N = A + B + C + D + E + F）。申请人应对无应答或无效应答产生原因进行分析，注意区分无应答或无效结果与模棱两可结果，如质控正常但结果无法识别的情况等。
2.2.2参考品准确性
各水平、各突变位点的阳性参考品均应按要求检出阳性，考虑到浓度梯度或突变梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应检出要求；阴性参考品在各个引物探针组合的检测条件下均应检出为阴性。
2.3检测限
明确可接受的最低检测限（Limit
of Detection，LoD），并明确无效应答或无应答检测结果的可接受标准。为预期用途中包含的每种变异类型建立LoD。如果检测人工混合的样本（如嵌合样本），需要考虑不同的等位基因比率，确定检测限。
试剂LoD的研究中应在常规临床实验室条件和确定的样本类型下进行。通常，LoD值采用分析物最低浓度计算得出，在此浓度下，可从相应检测重复中获得至少95%的阳性检出和可接受水平的无应答或无效应答。当不同的变异类型可能具有不同的LoD时，需要计算不同的序列被测区域范围中的每个变异类型的LoD。NGS检测方法可以同时检测多种类型突变基因，因此灵敏度的设置应根据不同突变基因类型及判读方式进行验证。
2.4空白限（检测基线）
应确认不会对报告区域的质量分数或覆盖率产生负面影响。应包含具有代表性的基因区域、变异类型和序列背景进行验证研究。设置空白检测限检测标准，设定评价方案及方法。
2.5分析特异性
分析特异性是评估产品仅可检测到预期待测变异的能力。根据预期用途和产品设计，一些潜在的内源性或外源性物质干扰和交叉反应或交叉污染可能会对产品检测性能产生影响。
交叉反应（如同源区域、假基因和其他类型的交叉反应序列）可能导致错误检测，从而产生假阳性结果。患者标本的交叉污染可能将其他不正常的序列引入到检测中，从而导致假阳性或假阴性结果。因此，应选择产品预期用途所覆盖样本或样本类型以及DNA提取方法中相关的干扰物质开展研究。同时，应对已知交叉反应的等位基因和同源区域进行评估。
2.6精密度
精密度研究主要是指使用相同的样本（包括检测临界值附近的样本）在各种特定条件下进行检测（如不同操作员，不同操作条件，不同检测天数，不同仪器等），并考虑检测中主要的变异来源。申请人应评估变异和野生型基因的精密度，其中应分别报告不同检测区域和变异类型的检测值。申请人应使用客观证据和有效的统计方法来验证这些指标设定标准。对可能导致检测结果多样性的主要因素进行评价，包括但不限于检测多个样本、不同检测批间、不同适用机型、试剂批次、检测天数和操作员。此外，申请人应考虑外部因素相同的情况下，应进行申报试剂在相同或相似被测物的重复性检测以评价检测结果。申请人需对每个检测条件和检测区域下每个变异类型精密度分别进行报告，还应报告无应答或无效应答的百分比。
2.7体细胞与胚系突变鉴别研究（如适用）
申请人需提交资料明确申报产品如何有效鉴别胚系突变，申请人无论使用何种方法，都应遵循保证准确检测的原则。如：对肿瘤样本进行检测的同时对该患者正常配对样本（正常癌旁组织或外周血白细胞）进行检测，根据配对样本与癌组织样本中鉴定出的突变信息进行鉴别筛选，应确认样本中特有的基因多态性，并明确混合后的每个多态性位点的预期频率。当无配对样本时，申请人需提供如何有效区分体细胞突变和胚系突变鉴定标准并提供相关研究资料。
2.8批次互通性（如适用）
NGS的检测通常包括试剂，消耗品，仪器和软件。各部分相对独立，申请人需对各批次之间是否互通进行研究。
2.9生物分析流程的性能补充研究（如适用）
当临床样本、细胞系或生物合成材料不可用或无法完全覆盖生物分析流程时，可以使用含有各种要求类型的已知序列变异（如：SNV、插入、缺失、结构变异等）的计算机构建的序列标本。申请人可采用软件编辑满足验证需要的模拟样本或数学模型，对生物分析流程进行补充验证。这些数据文件应使用与申报产品相同的预分析和分析方法来生成。需要注意，编辑样本不能替代生物学样本，只能作为生物学样本不能满足所有验证条件下的补充情形。
2.10其他
评估检测局限性时，申请人应采用特殊样本，如大于特定大小的插入或缺失或重排，并确定检测无法以预期的准确度和精确度检测到的序列变化类型。如果这些区域是申报产品检测预期用途的一部分，则需要验证高度同源、高度多态或其他困难区域的变异的检测性能。如果被检测的基因区域的一部分难以测序并且不能达到性能阈值，则应该将其报告为检测局限性。如适用，申请人应记录申报产品不会报告的检测类型。
在设计和验证过程中，申请人应记录所有检测失败情况并分析原因。例如，由于未能满足其一个或多个检测运行质量指标等。不符合质量标准的检测区域不应报告变异结果。由于未能达到检测运行质量标准而未被检测到的区域，则应如实报告。
申报产品上市后，通过上市后临床数据收集和分析或药品说明书中明确具有伴随诊断用途的基因，在不改变原有反应体系和检测方式等情况，申请人可通过收集本产品临床有效性资料申请变更其临床用途。
二、 名称解释
通量测序（High-throughput sequencing）：又称下一代测序技术（Next-generation
sequencing），可以一次性对数百万条核酸分子进行大规模平行测序。
全基因组测序：对某种生物基因组中的全部碱基进行测序，即把细胞内完整的基因组序列从第一个DNA分子开始直到最后一个DNA分子完整检出，并按顺序排列。
从头测序（de novo sequencing）：即不依赖于任何已知的基因组参考序列和其他序列信息，而直接对某个物种的全基因组DNA进行测序，然后利用生物信息学工具对下机序列进行拼接和组装，从而获得该基因组的全序列或连续的大片段.
永生化正常人白细胞：将正常人的白细胞进行体外培养，并通过基因转染等技术将外源性永生化基因，如病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等，导入目的细胞内以增加永生化的发生率，从而得到的永生化细胞株。
变异丰度：变异基因型在所有基因型中所占的比例，计算方式为变异基因型数量除以野生型和变异型基因总量。
变异频率：变异基因型在总人群中的基因频率。
原始reads数：经过高通量测序后，测序下机数据总reads数。
有效测序深度（如经过去重处理等）：去除PCR重复等后的平均深度。
符合最低测序深度和平均测序深度要求的区域（%）：最低测序深度和平均测序深度均大于阈值的区域数与区域总数的比值。
GC含量（GC content）：在测序所得的所有碱基中G（鸟嘌呤）和C（胞嘧啶）两种碱基数与所有碱基数的比值。
覆盖率：测序覆盖区域占总目标区域的比例。
最小覆盖标准：测序覆盖区域占总目标区域的最小比例阈值。
碱基识别质量值（base call
qualityscores）：衡量测序质量的重要指标，指测序得到的碱基的可靠性程度，基因的高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值（base
call quality，Q），用于衡量测序准确度。质量值越高表示碱基识别越可靠，碱基被测错的概率越小。
锚定序列：测序芯片上随机分布的两种不同的寡核苷酸序列，用于与测序文库结合。
索引（条形码）序列：index标签序列或barcode标签序列，指在文库构建过程中引入的一段标签序列，用于多样品同时测序时区分不同样本的序列。
无应答或无效应答：测序结果失败或测序数据低于质量控制标准判定结果无效。
四、参考文献
1.李金明等.高通量测序技术，科学出版社 2018.12
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五、起草单位
国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心。
附件2
CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂注册技术审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是对CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，也不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、 适用范围
药物代谢酶在药物体内代谢过程中起着重要作用，其活性强弱是药物代谢速率的重要影响因素，直接决定了药物作用的强度和持久性。人体内的药物代谢酶主要有细胞色素P450（CYP450）同工酶和N-乙酰转移酶（NAT）等。CYP2C19酶是一种重要的CYP450同工酶，临床以CYP2C19酶为主要代谢酶的药物包括抗血小板药物（如：氯吡格雷）和质子泵抑制剂等。氯吡格雷是一种抗血小板药物，广泛用于：急性冠脉综合征（ACS）患者，包括非ST段抬高性ACS（不稳定性心绞痛UA或非Q波心肌梗死）和ST段抬高性心肌梗死（NSTEMI）患者，其中，非ST段抬高性ACS包括经皮冠状动脉介入术后置入支架的患者；外周动脉性疾病患者；近期心肌梗死或近期缺血性卒中患者。氯吡格雷作为一种前体药物，本身并无药理活性，主要经CYP2C19酶代谢活化，产生活性代谢产物，后者与血小板表面的P2Y12受体不可逆结合，抑制血小板聚集，干扰ADP介导的血小板活化，发挥抗血小板效应。
CYP2C19酶的编码基因为CYP2C19基因，位于人类10号染色体上。CYP2C19基因含有42个等位基因，CYP2C19*1为野生型等位基因，其编码的酶具有正常活性。
CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）和CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）编码的CYP2C19酶活性降低，是中国人群中存在的2种主要的等位基因，在中国人群的发生频率分别为23.1%～35%和2%～7%。
CYP2C19*17（rs12248560,c.-806C>T）编码的CYP2C19酶活性增强，在中国人群的发生频率约为0.5%～4%。除CYP2C19*2/*3/*17之外，可能影响CYP2C19酶活性的CYP2C19等位基因还包括CYP2C19*4～CYP2C19*8等，但这些等位基因在中国人群的发生频率低，其功能与临床意义有待进一步研究。
CYP2C19基因的遗传变异导致CYP2C19酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者（UM）、快代谢者（EM）、中间代谢者（IM）和慢代谢者（PM）4种表型。CYP2C19UM患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内生成的活性代谢产物增多，对血小板的抑制作用升高，抗血小板功能增强，出血风险增大。而CYP2C19PM患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内生成的活性代谢产物减少，对血小板的抑制作用下降，抗血小板功能减弱，血栓风险增大。UM个体的基因型可为CYP2C19*17/*17纯合型或CYP2C19*1/*17杂合型；EM个体的基因型可为CYP2C19*1/*1纯合型；IM个体的基因型可为CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*17或CYP2C19*3/*17杂合型；PM个体的基因型可为CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3杂合型或纯合型。
通过CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测，可将服药人群分为上述4类氯吡格雷代谢患者，从而用于氯吡格雷的用药指导。美国FDA在氯吡格雷药物说明书中建议：对于CYP2C19PM患者，可考虑使用其他血小板P2Y12抑制剂。遗传药理学知识库以及临床遗传药理学实施联盟（CPIC）发布的CYP2C19基因型和氯吡格雷用药指导文件建议：对于CYP2C19PM患者和IM患者，可选用其它抗血小板药物（如：普拉格雷或替格瑞洛）进行治疗。2015年，原国家卫生计生委发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）》也建议：对于CYP2C19PM患者的抗血小板治疗，可增加氯吡格雷的剂量或选用其他不经CYP2C19代谢的抗血小板药物（如替格瑞洛）等。
然而，对于哪些氯吡格雷服药人群需进行CYP2C19基因型检测，国内外尚无统一意见。2013年发布的《抗血小板治疗中国专家共识》建议：CYP2C19基因型检测临床应用价值有限，不推荐常规进行。CPIC在随后发布的CYP2C19基因型和氯吡格雷用药指导文件中建议：基于CYP2C19基因型的氯吡格雷抗血小板治疗主要用于进行经皮冠状动脉介入治疗的急性冠脉综合征患者（简称为ACS/PCI患者），尚无证据表明CYP2C19基因型可用于指导氯吡格雷在其他患者中的抗血小板治疗。2014年发布的《抗血小板药物治疗反应多样性临床检测和处理的中国专家建议》建议：不推荐常规进行CYP2C19基因型检测，仅对PCI术后血栓高危、且计划调整P2Y12抑制剂治疗方案的患者，推荐进行血小板功能检测和CYP2C19基因型检测。2017年发布的《基因多态性与抗栓药物临床应用专家建议》建议：CYP2C19基因型检测主要对缺血高风险/出血高风险患者选用P2Y12抑制剂有参考价值。综合考虑上述意见并结合中国实际情况，建议将本指导原则的预期适用人群限定为：正在服用或将要服用氯吡格雷进行抗血小板治疗的冠心病患者，主要为急性冠脉综合征（ACS）且进行经皮冠状动脉介入治疗（PCI）的患者（ACS/PCI患者）、PCI术后血栓高危且计划调整P2Y12抑制剂治疗方案的患者、缺血高风险或出血高风险患者等。其中，PCI术后血栓高危患者以及缺血高风险/出血高风险患者的人群限定可参考相关指南。
本指导原则所述CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂是指：利用分子生物学检测技术，如聚合酶链反应（PCR）等，以CYP2C19基因特定序列为检测靶标，对接受氯吡格雷治疗患者的外周静脉全血或口腔拭子等样本基因组DNA中的CYP2C19基因多态性进行体外定性检测的试剂，用于氯吡格雷的用药指导。
本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法建立的，对于其他分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。
本指导原则仅对用于氯吡格雷用药指导的CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂的相关要求进行了说明，由于CYP2C19参与了多种不同药物的代谢，对用于其他药物用药指导的CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证。
本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
二、注册申报资料要求
（一）综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、检验原理、最低检测限及被测靶标（基因多态性位点）等方面详细说明申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。除此之外，还应说明被测靶标纯合型和杂合型在中国人群的发生频率。
若被测靶标为新的多态性位点，申请人还应提交支持资料，以证明：
1.携带新位点等位基因所编码的CYP2C19酶对氯吡格雷具有预期的代谢活性；
2.携带新位点等位基因的患者，其血小板功能具有预期的差异；
3.接受氯吡格雷治疗且携带新位点等位基因的患者表现出预期的主要不良心血管事件；
4.根据基因型调整抗血小板治疗方案后，携带新位点等位基因的患者预后获得改善。上述资料应为体内临床试验数据，如：在预期适用人群体内进行的酶速率研究试验，基因型与预期适用人群的主要不良心血管事件关联试验，基因型导向的抗血小板治疗试验等。上述资料必须包括基于中国人群的充分的临床数据。如新位点可用于氯吡格雷用药指导的结论已获得行业认可，应同时提交证明其获得行业认可的支持资料。
综述资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（原国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称《办法》）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（原国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号），以下简称《44号公告》的要求。
（二）主要原材料的研究资料
CYP2C19基因多态性检测试剂主要原材料研究资料包括主要反应成分、质控品及企业参考品的研究资料。
1. 此类产品的主要反应成分一般包括人基因组核酸提取/纯化试剂、检测所需引物、探针、酶、dNTP、反应缓冲液等。申请人应提交相关原材料的选择、制备和质量标准研究资料。如为申请人自制，应提交详细的工艺稳定性研究资料；如为外购，还应提交供应商筛选资料以及供应商提供的原材料质量检定报告。
1.1 核酸提取/纯化试剂（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。
1.2 引物、探针
本文所述CYP2C19基因多态性检测一般针对等位基因CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17。
申请人应详述引物、探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。建议设计两套或多套引物探针以供筛选，针对待测位点的检测灵敏度和特异性等进行评价，选择最佳设计，并提交详细的筛选研究数据。同时应针对引物、探针核酸序列及检测靶序列进行同源性比对，如有同源序列应着重评价是否会有交叉反应。申请人应针对选定的引物、探针原材料进行质量评价，一般包括：分子量、纯度（HPLC等）、浓度、探针荧光标记基团的激发波长和发射波长，以及功能性试验等，并依据评价结果建立合理的质量标准。
1.3酶
CYP2C19基因多态性检测试剂可能涉及到的酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）。申请人应针对各种酶的活性进行验证，提交功能性试验资料，并确定酶的质量标准。
DNA聚合酶应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性。UDG/UNG应具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。
1.4脱氧三磷酸核苷（dNTP）
包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；应提交对其纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料，以及功能性试验资料，并确定质量标准。
2.质控品
试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒质控品来实现。
CYP2C19基因多态性检测试剂的质控品可分别设置野生型、杂合型及纯合突变型DNA样品（至少包含常见的多态性位点），同时设置不含待测靶序列的空白质控品用于交叉污染的质控；亦可直接采用常见多态性位点的杂合型样品及空白质控品进行质量控制。
对于此类产品，一般情况下，反应体系中野生型序列和突变型序列均有阳性反应，可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，则试剂盒中可不另外设置内标对照；否则，应另外设置内标对照。质控体系应能够对检测全过程进行有效的质量控制，包括试剂及仪器性能、可能的扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染等因素造成的假阴性或假阳性结果。
质控品可采用质粒或临床样本的核酸提取液等。空白质控品应参与样本核酸的平行提取。申请人应针对质控品原料选择、制备、定值过程等提供详细的研究数据，并对质控品的检测结果做出明确的范围要求。
3.企业参考品
企业参考品主要包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品、精密度参考品等。申请人应提交有关企业参考品原料选择、制备方法、基因序列确认及检验标准的研究资料，包括所用到的参考方法等。
3.1阳性参考品：可采用临床样本或其核酸提取液，样本类型与待测样本一致。应至少包含野生型和所有多态性位点的杂合型样本，同时尽量纳入纯合突变型样本。对于某些稀有基因型，需要时也可采用细胞系代替。
3.2阴性参考品：应考虑检测特异性的评价，纳入同源序列交叉反应样本、干扰样本等。
3.3检测限参考品可选择最低检测限浓度（例如：95%检出率水平）或接近最低检测限浓度（例如100%检出率水平）的临床样本或其核酸提取液，至少包含所有多态性位点的杂合型样本。
3.4精密度参考品应至少包括所有多态性位点的低浓度杂合突变型临床样本或其核酸提取液。
如CYP2C19基因多态性检测试剂已有国家参考品，企业参考品的要求应不低于国家参考品要求。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料主要生产工艺研究资料包括工作液配制（引物、探针浓度、酶浓度、dNTP浓度、缓冲液离子浓度等）、分装和冻干（如有）、荧光标记等工艺过程的描述及确定依据。生产过程应对关键参数进行有效控制，可采用流程图方式描述生产工艺，标明关键工艺质控步骤，并详细说明该步骤的质控方法及质控标准。
反应体系研究指最佳反应条件的选择确定过程，包括样本采集预处理、样本保存、样本用量、试剂用量、核酸提取纯化步骤（如有）、PCR反应条件、阈值循环数（Ct值）等的确定。不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。
（四）分析性能评估资料
申请人应针对下述各项分析性能提交详细的评估资料，包括试验方法、试验样本（类型、来源、数量、处理方法、基因型和浓度确认）、试验可接受标准、统计方法、试验数据及结论等。有关背景信息也应在资料中有所体现，包括实验地点、适用仪器、试剂规格、批号等。分析性能评估的实验方法可以参考相关国内或国外有关体外诊断产品性能评估的指导原则进行。
每项性能评估应尽量采用与适用样本类型一致的临床样本，对于某些稀有基因型也可采用细胞系等。
如产品适用样本类型不止一种，申请人应针对不同样本类型分别完成性能评估。
1. 核酸提取/纯化性能（如有）
在进行靶核酸检测前，应有适当的核酸提取/纯化步骤。该步骤除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。无论检测试剂是否含有核酸提取/纯化的组分，企业都应结合检测试剂的特性，对配合使用的核酸提取/纯化方法的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证，并评价该方法能否满足CYP2C19基因多态性检测试剂的要求，提供详细的评价资料。
2. 检测准确性
建议采用若干份临床样本验证CYP2C19基因多态性试剂的检测准确性，样本类型与产品适用范围一致；样本应涵盖野生型和所有多态性位点的杂合突变、纯合突变情况，并包含不同基因组DNA浓度。对于某些基因型样本较为稀有的情况，亦可采用细胞系代替。
3. 检测限和可报告范围
CYP2C19基因多态性检测试剂的最低检测限可定义为：在满足一定的检测准确性和精密度的条件下，能够检出目标基因的最低人基因组DNA浓度。检测限评价建议采用临床样本或细胞系，并至少包含所有多态性位点的杂合突变型。
可采用梯度浓度的人基因组DNA样本进行多次重复检测，确定适当检出率水平（如：95%）下的最低人基因组DNA浓度，即为最低检测限。系列稀释度应能够覆盖大部分检出概率区间（0～100%），可根据各浓度梯度检测结果直接判定，也可通过概率计算或其他适当方法进行测算。
同时，申请人亦应评价CYP2C19基因多态性试剂可准确检出的人基因组DNA浓度上限，即适当检出率水平下的最高人基因组DNA浓度。
4. 分析特异性
4.1 应针对同源性序列（例如CYP2C19的其他突变序列、CYP2C9基因序列等）进行交叉反应验证，说明交叉反应样本的制备方法、核酸序列确认方法，提交详细的验证资料。
4.2 应针对可能的内源和外源性干扰物进行干扰试验研究。干扰物的选择与所用样本类型有关，例如：全血样本，内源干扰物主要涉及血脂、胆红素、血红蛋白和白蛋白等，外源干扰物主要包括血液样本采集可能用到的抗凝剂、常用药物等；对于口腔拭子样本，干扰物需考虑全血、口腔定植菌以及口腔可能接触到的抗菌漱口液、牙膏、食物、药物、烟草等。
干扰试验可通过在临床样本中人工添加干扰物质的方式，评
价干扰物质对目标基因检测的影响，也可直接采集暴露于干扰因素后的受试者样本，进行干扰试验评价。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价；如有干扰，应确定不产生干扰的最高浓度。
5.精密度
精密度评价应采用临床样本进行试验，试验操作完全按照说明书执行，包含核酸提取/纯化等样本处理步骤。样本应至少涵盖所有多态性位点的杂合突变型。
精密度评价需满足如下要求：
5.1对可能影响检测精密度的主要因素进行验证，除检测试剂（包括核酸提取/纯化组分）本身外，还包括分析仪、操作者、地点、时间、检测轮次、试剂批次等。
5.2设定合理的精密度评价周期，对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间重复性进行评价。
5.3用于精密度评价的临床样本应根据可报告范围的基因组DNA浓度至少设置低浓度和中/高浓度水平。
5.4精密度指标可设置为检测成功率等，申请人应对精密度指标评价标准做出合理要求。精密度评价资料应详述试验设计、试验数据、统计分析及试验结果，列出有关试剂、仪器、实验室、人员、样本的相关信息。
（五）阳性判断值确定资料
对于此类试剂，阳性判断值即为能够获得理想的检测准确性的临界值（Cut-off）。建议纳入一定数量的临床样本，涵盖野生型和所有多态性位点的突变型，采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式进行研究。相关资料中应详述试验方案、样本来源、样本量、样本入组标准及试验结果等。
应针对不同样本类型（如有）分别进行阳性判断值研究，明确是否有差异。
如果试剂判读存在灰区，应解释说明灰区范围的确定方法。对于某些检测方法学，阳性判断值研究可能不适用，申请人应说明理由。
（六）稳定性研究资料
稳定性研究资料主要包括申报产品的稳定性研究和适用样本的稳定性研究两部分。前者主要包括申报产品的实时稳定性、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性及冻融次数限制的研究等；后者则是指适用样本的保存条件、保存时间等方面的研究，如果包括多种样本类型，则需分别完成相关研究。申报产品实时稳定性研究中，应采用至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后，选取多个时间点进行产品性能评价，从而确定产品保存条件和有效期。
样本稳定性研究中，如核酸提取液不一定立即进行检测，则还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究。申请人应提交有关稳定性研究方案的确定依据、具体的试验方法及详细的研究数据、结论。
（七）临床试验
应满足《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（原国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求，下面仅说明本类试剂临床试验中应关注的重点问题。
1. 临床试验机构申请人应当选定不少于3家（含3家）临床试验机构，按照相关规定开展临床试验。申请人应根据产品特点及预期用途，综合不同地区人种和流行病学背景等因素选择临床试验机构。
2. 临床试验人群正在服用或将要服用氯吡格雷进行抗血小板治疗的冠心病患者，主要为急性冠脉综合征（ACS）且进行经皮冠状动脉介入治疗（PCI）的患者（ACS/PCI患者）、PCI术后血栓高危且计划调整P2Y12抑制剂治疗方案的患者、缺血高风险或出血高风险患者等。其中，PCI术后血栓高危患者以及缺血高风险/出血高风险患者的人群限定可参考相关指南。
3. 临床样本应为临床原始样本，如静脉抗凝全血等，不应直接采用提取的基因组DNA进行试验。临床样本的采集、处理、保存和提取等应同时满足申报产品说明书以及对比试剂说明书（如适用）的相关要求。
4. 临床试验样本量如申报产品同时适用于静脉全血或口腔拭子等不同基质的样本类型，则每种样本类型的例数应分别满足法规要求。
5. 临床检测准确性验证
5.1 对比试剂
5.1.1已有同类产品上市的申报产品对于已批准的CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）、CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）以及CYP2C19*17（rs12248560,c.-806C>T）多态性位点，可选择已上市同类试剂作为对比试剂。
5.1.2 无同类产品上市的申报产品对于新的多态性位点，可选择基因测序作为对比方法。
5.1.3基因测序应提交临床试验机构和测序机构签章的委托测序协议。应对选用的测序方法做详细介绍，应提供以下关于测序的详细试验资料，该部分资料需由临床试验机构签章。
5.1.3.1测序原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品的相关信息。
5.1.3.2测序方法所用引物信息，如核酸序列、分子量、纯度、功能性实验等资料。引物设计应涵盖申报产品扩增的被测靶标。
5.1.3.3 测序方法的性能验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序方法与申报产品的性能进行比对分析。
5.1.3.4 测序方法应建立合理的阳性和阴性质控，以对临床样本的检测结果进行质量控制。
5.1.3.5 提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。
6. 氯吡格雷指导用药临床有效性的验证
6.1 已有同类产品上市的申报产品已批准的CYP2C19*2（rs4244285，c.681G>A）、CYP2C19*3（rs4986893，c.636G>A）以及CYP2C19*17（rs12248560,c.-806C>T）多态性位点，无需进行该部分验证。
6.2 无同类产品上市的申报产品
6.2.1如新多态性位点用于氯吡格雷用药指导已获行业认可（包括：CPIC、国内相关指南或专家共识、相关药物说明书以及临床应用等的认可），且有充分的中国人群的体内临床数据，无需进行该部分验证。
6.2.2如新多态性位点用于氯吡格雷用药指导未获行业认可，应提交基于中国人群的充分的体内临床数据，包括但不限于：6.2.2.1新的多态性位点等位基因编码的CYP2C19酶对氯吡格雷的代谢动力学验证资料。
6.2.2.2血小板功能检测。比较不同基因型患者血小板功能的差异。
6.2.2.3基因型与主要不良心血管事件关联性的体内临床试验。
6.2.2.4基因型可指导氯吡格雷用药的有效性证据。
6.2.3 需要强调的是，对于6.2所述申报产品（包括6.2.1和6.2.2），申请人应在临床试验资料部分提交声称的新多态性位点已获行业认可的相关资料以及基于中国人群的充分的体内临床数据等，以证明申报产品可指导氯吡格雷用药。
7. 临床试验方法、数据及统计分析
7.1应在临床试验方案或报告中描述申报产品和对比试剂/方法的试验方法。
7.2临床试验原始数据应以列表方式表示，包括申报产品的结果、对比试剂/方法的结果、临床诊断、年龄、性别以及是否进行PCI等。
7.3应总结野生型、各多态性位点杂合型和纯合突变型的例数，以交叉四格表分别总结两种试剂对各多态性位点的定性检测结果，并分别计算各多态性位点基因型的阳性符合率、阴性符合率、总体符合率及其95%置信区间，对定性结果分别进行四格表卡方或kappa检验，以验证两种试剂检测结果的一致性。
7.4 结果差异样本的验证在数据收集过程中，对于两种试剂检测结果不一致的样本，应采用合理方法进行复核，并对差异原因进行分析。如无需复核，应说明理由。
8. 临床试验方案
各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程。试验方案应确定严格的入选/排除标准，任何已入选的样本被排除出临床试验都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程和结果判定时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各临床试验机构选用的对比试剂/方法应保持一致，以便进行合理的统计学分析。另外，申报产品的样本类型不应超越对比试剂/方法对样本类型的要求。
9. 临床试验报告
应对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的数据和统计分析方法。（八）产品技术要求产品技术要求应符合《办法》《44号公告》和《医疗器械产品技术要求编写指导原则》（原国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的相关要求。
该类产品作为三类体外诊断试剂，应将主要原材料、生产工艺及半成品要求等内容作为附录附于技术要求正文后。如果申报产品已有相应的国家/行业标准发布，则企业标准的要求不得低于上述标准要求。
（九）产品检验报告
根据《办法》的要求，第三类体外诊断试剂申请注册时应提交连续三个生产批次样品的检验报告。如有国家标准品/参考品的检验项目，应在产品检验时采用。
（十）产品说明书
产品说明书应满足《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（原国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求，产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致。
下面对CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂说明书的重点内容进行阐述。
1.【预期用途】
应至少包括以下几部分内容：
1.1本产品用于体外定性检测人体xx样本中的yy基因多态性，可检测的多态性类型包括aa，本产品用于氯吡格雷的用药指导。本产品不能预测患者对氯吡格雷的应答情况，仅能辅助医生确定氯吡格雷治疗策略。本产品检测结果仅供临床参考，不应作为患者是否用药的唯一依据，临床医生应结合患者病情、疗效及其他实验室检测指标等对本产品的检测结果进行综合判断。
1.2介绍被测靶标（基因多态性位点），明确各多态性杂合型和纯合型的临床发生频率，明确可进行氯吡格雷用药指导的适用人群，明确不同基因型与氯吡格雷的关系。
2.【主要组成成分】
2.1说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。
2.2试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，企业应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其他相关信息。
2.3如果试剂盒中不包含用于核酸提取纯化的试剂组分，则应在此注明经过验证后配合使用的商品化核酸提取纯化试剂盒的生产企业、产品名称以及产品货号和医疗器械备案号（如有）等详细信息。
3.【检验原理】
3.1对试剂盒的被测靶标进行详细描述（基因位置、多态性位点及相关特征等），对试剂盒所用探针、引物、多态性的判定终点等进行详细的介绍；对不同样本反应管组合、质控品设置及荧光信号检测原理等进行介绍。
3.2试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。如反应体系中添加了相关的防污染组分（如UNG酶），也应对其作用机理进行适当介绍。
4.【储存条件及有效期】
说明试剂盒的效期稳定性等，应明确具体的储存条件及有效期等信息。
5.【样本要求】
样本的采集、处理、运送和保存：明确样本采集、核酸提取纯化前的处理（如离心和洗涤等）、保存条件及期限（短期和长期）以及运送条件等。冷藏/冷冻样本检测前是否需要恢复至室温，冻融次数的限制等。
6.【适用仪器】
所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。
7.【检验方法】
详细说明实验操作的各个步骤，包括：
7.1实验条件：实验室分区、实验环境的温度、湿度和空调气流方向控制等注意事项。
7.2试剂配制方法和注意事项。
7.3详述核酸提取纯化的条件、步骤及注意事项（如适用），对核酸提取纯化环节进行合理的质量控制，明确提取核酸的浓度纯度等质量要求。
7.4扩增反应前准备：加样体积、顺序等。
7.5 PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置或相应的自动化检测程序及相关注意事项。
7.6仪器设置（如适用）：特殊参数、探针的荧光素标记情况、对待测多态性及其他质控品的荧光通道选择等。
8.【检验结果的解释】
结合质控品、样本管检测结果以及多态性类型与氯吡格雷表型之间的关系，以列表形式详述所有可能出现的结果及相应的解释。如存在检测灰区，应详述对于灰区结果的处理方式。
9.【检验方法的局限性】
9.1申报产品仅对下述多态性类型xx进行了验证。
9.2有关假阴性结果的可能性分析
9.2.1不合理的样本采集、运送及处理或核酸过度降解均有可能导致假阴性结果。
9.2.2未经验证的其他干扰或PCR抑制因子等可能会导致假阴性结果（如有）。
10.【产品性能指标】
简述以下性能指标：
10.1最低检测限：简单介绍最低检测限的确定方法，并明确最低检测限结果。
10.2阳性/阴性参考品符合率。
10.3精密度：简单介绍精密度的确定方法，并明确精密度结果。
10.4分析特异性
10.4.1交叉反应验证：同源性序列等交叉反应验证。
10.4.2干扰物质验证：样本中常见干扰物质对检测结果的影响。
10.5对比试验研究（如有）：
简要介绍对比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。
11.【注意事项】
应至少包括以下内容：
11.1如该产品含有人源或动物源性物质，应给出具有潜在感染性的警告。
11.2临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号或现行有效版本）等有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。
三、起草单位国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心。
来源：国家药监局
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